乳清蛋白的测定

Milk powder and formula foods for infant and young children

-Determination of whey protein

GB/T 5413.2—1997

1 范围

本标准规定了蛋白与乳清蛋白含量比率的测定方法。

本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中酪蛋白与乳清蛋白含量比率的测定。

2 方法提要

试样用SDS-聚苯烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，Laemmli法）后，用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定，求得酷蛋白与乳清蛋白的含量比率。

3 试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

3．1  电泳缓冲液：将Tris（hydroxymethyl）aminomethane7.5 g、甘胺酸36g、SDS2.5g溶于蒸馏水中，定容至500mL。使用前以蒸馏水稀释5倍后使用。

3．2  SDS试样缓冲液：0.125mol/L Trsi-盐酸（pH6.8），体积分数20%的甘油，4%（m/V）SDS，体积分数10% 2-mercaptoethanol，质量分数0.0025%的溴酚蓝（bromophnol blue）。

3．3  染色剂：质量分数0.1%考马斯蓝R-250（Coomassie brilliant blue R-250），体积分数10%的甲醇，体积分数7.5%的乙酸。

3．4  脱色剂：体积分数10%的甲醇，体积分数7.5%的乙酸。

3．5 酪蛋白。

3．6 精制乳清蛋白（WPC）。

3．7 SDS-PAGE：用梯度凝胶（10%～20%）或同效凝胶。

4 仪器

常用实验室仪器及：

4．1 平板式电泳槽。

4．2 供电设备。

4．3 光密度计。

5 操作步骤

5．1 样液的制备

将试剂按蛋白质10～20µg/µL 的浓度范围溶解在蒸馏水中。加入与试样同体积的SDS试样缓冲液，在煮沸热水中静置5 min，作为试样液。

5．2 标准溶液的制备

使用前，酪蛋白和乳清蛋白的蛋白质浓度按凯氏（Kjeldahl）法精确测定。将酪蛋白和乳清蛋白按上述方法分别进行溶解和处理后作为标准溶液。此外，还可将酪蛋白与乳清蛋白的标准溶液按蛋白质含量的任意比率（比如蛋白质的浓度比为75：25，50：50，25：75）进行混合作为混合标准溶液。

5．3 电泳

将凝胶设置在电泳槽中，加入电泳缓冲液。试样溶液与标准溶液的添加量为每孔10µL。电泳时间因电泳凝胶的种类不同而异。以10%～20%的梯度复合凝胶进行电泳时，定电流为40mA，时间为60min。电泳结束时间可按溴酚蓝的蓝谱带到达离凝胶下端5mm时为标志。电泳结束后将凝胶放入染色液中振荡染色1h，然后转入脱色液中振荡脱色12h再移到蒸馏水中。

5．4 测定

以光密度计对带色的各谱带进行测定，求得其颜色深度（OD）的积分值（=Trace值）。

6 分析结果的表述

6．1 谱带的测定

电泳后的谱带中，参照分子量以及标准酪蛋白与乳清蛋白的电泳图，分别选择以下谱带进行计算。

（1） 酷蛋白：α₃-酪蛋白（分子量23500），β-酪蛋白（分子量24000），κ-酪蛋白（分子量19000）；

（2） 乳清蛋白：α-乳白蛋白（分子量14000），β-乳球蛋白（分子量18000），血清白蛋白（分子量66000）。

6．2 计算方法

将以上三种酪蛋白谱带的Trace值合计，再除以该条泳线中所有谱带的Trace值的总和，求得酪蛋白的比率（C₁值）。以同样方式将以上三种乳清蛋白谱带的Trace值合计，再除以该条泳线中所得谱带Trace值的总和，求得乳清蛋白的比率（W₁值）。

当以酪蛋白与乳清蛋白的单独溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得标准酪蛋白的C1 值（=C_s值）与标准乳清蛋白的W₁值（=W₁值）。将试样的C₁值与W₁值，求得暂定的酪蛋白含量比率（C₂值）与乳清蛋白的含量比率（W₂）。当C₂值+W₂值不等于1时，将C2 值、W₂值分别除以C2值与W2值的总和进行补整，求得试样中的酪蛋白以及乳清蛋白的比率。

    当以酪蛋白与乳清蛋白的混合溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得各混合比率中酪蛋白的C1值与乳清蛋白的W1 值。将混合标准溶液的C1值与酪蛋白含量比，以及W₁值与乳清蛋白含量比做成坐标检量线，利用该检量线求得试样的C2 值与W₂值。当C₂值+W₂值不等于1时，将C2 值、W₂值分别除以C2 值与W₂值的总和进行补整，求得试样中酪蛋白以及乳清蛋白的比率。

国家技术监督局 1997—05—28 批准 1998—09—01 实施